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機構用戶解決方案

當前位置:首頁 > 互作蛋白質篩選與快速驗證解決方案 > Matchmaker® Gold酵母雙雜系統

 
    蛋白質在功能上的作用不是單個蛋白質孤立完成的,而是通過與其他蛋白質相互作用來完成的。在時間上,一個蛋白質可能需要順序性地與多個蛋白質相互作用;在空間上,一個蛋白質可能與其他若干個蛋白質組裝成為復合體執行功能。因此,鑒別蛋白質相互作用是研究蛋白質功能的基礎性工作。
    在相互作用持續時間上,蛋白質相互作用可以是持久性的也可以是短暫的,比如負責基因信息維護的酶很多是持久性地結合,比如在代謝過程中一些酶的相互作用就是相對瞬時性的;在相互作用的結合強度上,蛋白質相互作用可以是結合力強的,也可以是弱結合力的;有些方法是在體外進行判定(in vitro analysis),而有些方法是體內判定(in vivo analysis)。 因此,研究蛋白質相互作用往往需要配合使用若干種方法。
 
蛋白質互作研究常規方法 產品名稱
  相互作用持續時間   相互作用強度   體內判定/體外判定
酵母雜交   持久或瞬時   強或弱   體內
免疫共沉淀   持久   強   體內
GST-Pull down   持久   強   體外
蛋白質交聯(cross linking)   瞬時   弱   體外
 
酵母雙雜交技術
    酵母雙雜交技術是由Fields和Song在1989年提出的。該技術的產生是基于對酵母細胞的轉錄因子GAL4性質的研究。轉錄因子GAL4包括兩個結構域,分別是位于N端的DNA結合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端的轉錄激活域(Activati on domain,AD)。DNA-BD能夠識別并結合于GAL4效應基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)。而AD則是通過與轉錄機構(transcriptionmachinery)中的其他成分之間的結合作用,以啟動UAS下游的基因進行轉錄。當DNA-BD和AD分開獨立存在時,并不能激活轉錄反應,只有當二者在空間距離非常接近時,才會呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子,使啟動子下游基因得到轉錄。根據這個特性,將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質的基因構建在同一個表達載體上,所獲得的融合蛋白質叫做誘餌蛋白質(bait);將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構建在另一個表達載體上,所得到的融合蛋白質叫做獵物蛋白質(prey)。Bait和prey發生相互作用,形成完整的轉錄因子GAL4,使酵母菌基因組的效應基因表達。
 
 
技術優點:
1. 蛋白質相互作用發生在細胞內,蛋白質無需純化,并且可以在一定程度上代表細胞內的真實情況;
2. 適于大規模篩選,用已知的蛋白質從cDNA文庫中調取具有相互作用的蛋白質;
3. 可以檢測出存在于蛋白質之間的微弱的或瞬時的相互作用。
 
技術局限性:
假陽性:假陽性是指兩個待測蛋白質本沒有相互作用,但實驗卻顯示陽性結果。例如,由于某些蛋白質本身具有激活轉錄功能或在酵母中表達時發揮轉錄激活作用,使DNA結合結構域雜交蛋白質在無特異激活結構域的情況下就可以激活效應基因轉錄。另外,某些蛋白質表面含有對多種蛋白質的低親和力區域,能與其他蛋白質形成穩定的復合物從而引起報告基因的表達,產生"假陽性"結果。
 
【免疫共沉淀技術】
    免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎,用于確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時,細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。傳統的Co-IP方法通常是用能夠與瓊脂糖珠上偶聯的protein A特異性結合的抗體免疫沉淀A蛋白質,那么與A蛋白質在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來,以此來驗證預測的蛋白質是否具有相互作用。
 
 
技術優點:
1. 相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態;
2. 與酵母雜交技術相同,蛋白質的相互作用是在細胞內進行的,避免外界環境影響;
3. 實驗流程比酵母雜交的方法要簡單快速。
 
技術局限性:
1. 靈敏度要比酵母雜交方法低,可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;
2. 必須在實驗前對互作蛋白質進行預測,以選擇最后檢測的抗體,所以若預測不正確,實驗就得不到結果;
3. 篩選效率低,無法像酵母雙雜交的方法一樣從大量的未知的蛋白質中調出具有相互作用的蛋白質。
 
    Clontech品牌的兩款技術領先型產品,結合各自的優勢特點并互補不足之處,為研究強度較大的蛋白質相互作用提供了文庫級別的篩選和鑒別驗證的可靠解決方案。首先,酵母雜交產品線Matchmaker系列,可以用于體內大規模的初步篩選蛋白質相互作用候選目標。其次,Clontech品牌特有的CapturemTM技術,實現了基于膜上的蛋白質捕獲,從而使得免疫共沉淀純化部分的操作時間從傳統的數個小時減少到5分鐘左右,使實驗效率顯著提高。
 
實驗流程示意圖:
 
 
1. 自己構建酵母雙雜交文庫
DIY文庫,簡便而且快速。
    您可使用Make Your Own Mate & Plate Library System(630490)自己制作文庫。利用該系統,一周之內即可構建足夠用于數百次酵母雙雜交篩選實驗的所需文庫。文庫構建是在Y187文庫酵母菌株中通過酵母高效的同源重組機制直接完成的,無需進行傳統文庫構建過程中的一些繁冗的操作 (比如文庫克隆、擴增和大腸桿菌收集等)。
 
技術原理
 
 
    本系統利用Clontech品牌的SMART cDNA合成技術,使用任意組織來源的少至100 ng的總RNA,即可構建cDNA文庫。SMART技術利用了MMLV (Moloney murine leukemia virus) RT的末端轉移酶活性和模板轉換機制,合成的一鏈cDNA序列末端含有已知的通用引物結合位點。因此,SMART一鏈cDNA可以通過PCR進行擴增,然后與具有末端同源序列的Matchmaker Gold 獵物載體pGADT7-Rec進行重組?;諞隕咸卣?,使用納克級的RNA (例如來源于顯微解剖組織、激光捕獲細胞或者活檢樣品) 即可合成cDNA,共轉化這些cDNA和pGADT7-Rec到酵母菌株Y187中,即可直接構建文庫。
 
Make Your Own "Mate & Plate" Library System(630490)制品特點
· 利用SMART?技術在酵母中直接構建文庫
· 無需繁瑣的克隆或文庫擴增
· 足夠用于數百次的雙雜交篩選
 
2. 文庫蛋白質篩選方法
Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System(630489)
    Matchmaker Gold酵母雙雜交系統是酵母雙雜交實驗進行大規模文庫蛋白質篩選方法的核心工具,系統中包含專門用于酵母雙雜交實驗的工程菌株Y2H Gold,具有更加嚴謹的篩選報告基因;采用巧妙的設計將誘餌蛋白質與文庫蛋白質構建到不同類型的酵母菌中,利用酵母菌接合反應實現文庫篩選,方便于在百萬級別的文庫中調取互作蛋白質,實現真正意義上的大規模的互作蛋白質篩選。
 
Matchmaker酵母雙雜交系統的功能
· 發現新的與已知蛋白質互作的蛋白質
· 確認兩個蛋白質之間的相互作用
· 鑒定參與蛋白質相互作用的區域
 
技術原理:
    在基于GAL4的Matchmaker酵母雙雜研究中,bait蛋白質與GAL4的DNA結合域(BD)融合表達,而作為文庫的prey蛋白質與GAL4的激活結構域(AD)融合表達。當bait蛋白質與庫(prey)蛋白質有相互作用時,DNA-BD與AD之間相互接近從而激活4個相互獨立的報告基因(AUR1-C、 ADE2、HIS3和 MEL1)的表達。
 
 
    4個報告基因:Matchmaker Gold雙雜交系統采用1個AbA抗生素篩選報告基因、2個營養篩選報告基因、1個藍白斑篩選報告基因。
    當酵母雙雜系統只采用HIS3營養報告基因篩選蛋白質-蛋白質互作時,經?;嶧竦么罅康謀塵翱寺『圖傺糶?。背景克隆是由于營養報告基因泄露表達引起的,而假陽性是由于prey蛋白質無需與bait蛋白質互作即可識別和結合報告基因上游序列引起的。
    Matchmaker Gold系統是采用4個報告基因/3個不同bait識別序列的雙雜交系統。該系統采用新型的、穩定的酵母菌抗生素AbA,可以有效殺死非抗性克隆,從而大大降低了背景克隆的生長。4種報告基因同時作用,假陽性出現的概率大大降低。
 
Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System(630489)制品特點
· 較低的假陽性率
· 4個報告基因,包括Aureobasidin A(AbA)抗生素抗性篩選基因
· 簡便的“Mating”接合方法
 
3. 應用高效的Capturem 膜技術對蛋白質相互作用進行 Co-IP驗證
Capturem IP & Co-IP Kit(635721)
    Capturem IP & Co-IP Kit基于傳統Co-IP方法的技術原理,其創新之處在于采用特殊工藝將protein A作為配基固定在膜上,使純化介質由一定體積的樹脂變成一層薄膜,大大降低了柱床體積,從而大幅度縮短實驗時間,并提高純化效果。
 
Capturem IP & Co-IP Kit(635721)制品特點
· 簡單和快速的實驗流程:抗體與樣品孵育,之后在室溫下進行的純化僅需5 min
· 完整的解決方案:kit中包含用于IP和Co-IP實驗的Capturem Protein A純化柱和buffer,且均經過優化
· 高濃度:洗脫液體積小,產物濃度高
· 高質量:樣品在膜上停留時間短,避免復合物的凝集、解體或失活
· 通用性強:兼容寬泛的IP buffer和實驗條件
· 一次性使用:基于新型膜技術的一次性離心柱,能避免污染
 
Capturem 方法Co-IP實驗技術流程
 
 
    從流程圖中可以看出,抗體與蛋白質裂解液孵育后,從上樣到洗脫純化,僅需5 min就可以得到高質量的抗體-蛋白質-蛋白質復合物。由于樣品在Capturem 膜上停留的時間短,所以可以很大程度地避免了復合物的凝集、解體或失活,從而提高驗證實驗的成功率。
    需要注意的是,如果沒有合適的與天然蛋白質結合的抗體,可以考慮為目標蛋白質添加標簽,如Myc、HA、Flag等,之后采用標簽對應的抗體進行Co-IP實驗。由于這些標簽分子量都很小,所以一般不會對蛋白質的功能產生影響。Clontech品牌提供多種標簽蛋白質表達載體和相應的標簽抗體,可以滿足您在實驗上的多種需求。